На чтение: ≈ 21 мин.Универсальный метод редактирования генома назван самым большим прорывом в области биотехнологий после разработки полимеразной цепной реакции.
Изучение генов человека, животных и растений открыло возможность для широкого применения этих знаний в медицине и биотехнологии. В постгеномную эру ХХI века начали развиваться методы внесения модификаций в последовательности геномов и возросла требовательность к их эффективности, то есть назрела необходимость в разработке методов высокоточного редактирования ДНК.Из известных на сегодня инструментов направленной манипуляции с генетическим материалом с 1996 года распространены ZFNs («цинковые пальцы»), более эффективные TALENs (в 2011 году журнал Nature Methods назвал их методом года), а также система CRISPR, впервые примененная в 2013 году. ИсторияВ 60-70-х годах прошлого столетия зародилась генная инженерия. Толчком для ее развития стало открытие ферментов рестрикции и ДНК-лигаз. Рестриктазы «узнают» определенные короткие нуклеотидные последовательности и расщепляют по ним молекулу ДНК; ДНК-лигазы используются для «сшивания» нуклеотидных фрагментов. Так, путем добавления, изменения или удаления последовательностей по сайту рестрикции модифицируют или получают новые генетические конструкции на основе относительно коротких ДНК геномов бактерий и вирусов. Однако манипулировать большими и сложными геномами растений и животных (в том числе в составе живых клеток) подобным образом невозможно.Поэтому был выработан совершенно новый подход к расщеплению ДНК путем создания специальных химерных ферментов с двумя структурными единицами, одна из которых катализирует расщепление ДНК (нуклеаза), а вторая избирательно связывается с определенными нуклеотидными последовательностями в составе целевой молекулы, направляя на этот участок действие нуклеазы. Первыми среди химерных нуклеаз стали «цинковые пальцы» (zinc-finger nucleases, или ZFNs, – белковые домены с молекулой цинка, по форме напоминающие пальцы), каждый такой «палец» способен распознавать и специфично связываться с определенной последовательностью ДНК из трех нуклеотидов. Однако метод давал множественное расщепление ДНК в «нецелевых» участках, кроме того, оказался весьма дорогостоящим, поскольку для каждой последовательности ДНК надо было создавать свою оптимизированную структуру химерной нуклеазы. Большим прорывом явилось то, что редактирование геномов стало возможно в живой клетке.Более перспективным способом для избирательного воздействия на ДНК стали конструкции на основе химерных нуклеаз с белковыми доменами, напоминающими эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции у некоторых бактерий (transcription activator-like effector nucleases, или TALENs). В данном случае каждый из белковых доменов TALE распознает один нуклеотид, поэтому создать конечную конструкцию достаточно просто, исключены недостатки предшествующего метода.Оба метода достаточно трудоемки, объективно средне эффективны и дорогостоящи, однако они продолжают применяться в сфере клинических исследований.В 2013 году был разработан революционный метод применения системы CRISPR-Cas для редактирования высших геномов. Он позволяет делать с геномом абсолютно все: осуществлять точечные мутации, встраивать в определенные места генома новые гены и последовательности, удалять или модифицировать крупные участки нуклеотидных последовательностей.Необходимо знатьУ 87% архей и 48% всех бактерий в ДНК находятся множественные идентичные повторы, разделенные неидентичными уникальными участками (спейсерами). Они названы CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, т. е. «сгруппированные регуляторные разделенные промежутками короткие палиндромные повторы». Функция этой системы – адаптивный прокариотический иммунитет для защиты от вирусов и плазмид, она очень похожа на эукариотическую систему РНК-интерференции. CRISPR-система располагается на хромосоме и состоит из геномных кассет для записи (или уже с записью при повторной встрече) информации о вражеском агенте и Cas-белков, обеспечивающих молекулярный механизм иммунитета. В такой структуре присутствуют повторы, спейсеры и лидерная последовательность длиной около 400 пар нуклеотидов (она не кодирует белки, но задает направление транскрипции). При встрече с неприятелем из его генома вырезается участок и встраивается в CRISPR-кассету в виде спейсера, затем кассета экспрессируется (служит матрицей для синтеза первичного РНК-предшественника), одновременно синтезируются Cas-белки, объединяясь в комплекс. Этот комплекс разрезает длинный РНК-предшественник на короткие CRISPR-РНК, включающие один спейсер каждая, которые затем связываются с комплексом Cas. Такой Cas-CRISPR-РНК-комплекс и начинает иммунный ответ: он прикрепляется к вирусной ДНК точно в месте, соответствующем сохраненному в виде спейсера фрагменту, и разрезает ее с помощью одного из белков группы Cas, уничтожая вирус. Созданная на основе природной искусственная генетическая конструкция, используемая учеными для редактирования геномов, упрощена. Она включает два принципиально важных элемента: один из них кодирует направляющую РНК (структурами, узнающими ДНК, здесь являются короткие РНК в отличие от химерных нуклеаз), тогда как другой кодирует ген самой нуклеазы. Единая направляющая РНК состоит из трансактивирующей РНК (tracrРНК), которая взаимодействует с нуклеазой, и короткой CRISPR-РНК (crРНК), которая распознает целевой участок ДНК (в наиболее современном варианте tracrРНК и crРНК связаны соединяющей петлей). В качестве нуклеазы наиболее активно используется фермент Cas9. После доставки такой конструкции в клетку направляющая РНК-последовательность распознает геномный локус-мишень и комплементарно связывается с ним, а Cas9 разрезает ДНК в нужном месте (см. схему 1).Краткая справкаCRISPR-последовательности впервые были открыты в 1987 году, их биологическая функция описана в 2010-2012 годах лабораториями J.Doudna и E.Charpentier, а применение системы CRISPR-Cas9 для редактирования генома млекопитающих впервые осуществлено в 2013 году независимо лабораториями G.Church и F.Zhang. На сегодня эта система проще всех в плане конструирования.Такая система позволяет разрезать обе нити ДНК в строго определенном месте (либо одну цепь ДНК с помощью модифицированных версий Cas9, что активно используется учеными для исследований). Восстановление цепи ДНК в месте разреза (репарация), которое необходимо для поддержания стабильности генома, происходит либо путем негомологичного соединения концов, либо методом гомологичной рекомбинации. Негомологичное соединение концов в ряде случаев приводит к потере генетической информации или мутациям в исходном сайте разреза ДНК, что используется для «выключения» генов-мишеней. Если же в клетку доставить искусственно синтезированную последовательность-вставку, которая гомологична месту разрыва, то можно произвести либо замену геномного локуса-мишени, либо встройку дополнительной генетической информации методом гомологичной рекомбинации.В конце 2015 года, то есть спустя буквально два года, F.Zhang с коллегами описали новую систему CRISPR-Cpf1, способную редактировать человеческий геном. Это уже следующее поколение технологии редактирования генома, поскольку система отличается от Cas9 более простым устройством: ей требуется лишь одна молекула crРНК (Cas9 нужны две), а ее размер (а также стоимость) – меньше. Кроме того, Cpf1 несколько иначе разрезает ДНК (одна нить короче другой), что минимизирует неконтролируемые мутации и помогает делать более точные вставки. Cpf1 также делает разрез дальше от участка распознавания, что позволяет редактирование генома даже в случае мутации в месте разреза. Неожиданно!Система CRISPR-редактирования может быть применена в мутагенной цепной реакции, т. е. таким образом возможно вносить изменения в геномы целых популяций. Для этого после прицельного разрезания участка генома системой надо провести репарацию ДНК путем гомологичной рекомбинации с использованием последовательности-вставки, доставленной в клетку в составе CRISPR-плазмиды. После вставки новой последовательности в первом раунде система совершит двухцепочечный разрез ДНК в соответствующем аллельном, и при повторном раунде гомологичной рекомбинации исходная клетка перейдет из гетерозиготного состояния (один модифицированный аллель) в гомозиготное (оба аллеля модифицированы), что будет означать полное наследование нововведенной генетической информации с использованием системы CRISPR-Cas. Для биотехнологии выведение популяций с запрограммированными свойствами, к тому же быстрое и экономичное, – настоящая революция.Эксперименты – только научныеВ бюллетене об «Оценке международной угрозы безопасности» США редактирование генома включено в один ряд с другими орудиями массового уничтожения – ядерными ракетами, химическим оружием. Эксперименты над человеческими эмбрионами законодательно запрещены (вернее, разрешены лишь для фундаментальных научных исследований, но не в медицинской практике). На сегодня опыты широко проводятся в двух странах – Великобритании и Китае. В Англии, например, «отредактированные» эмбрионы нельзя доводить до состояния плода, их также запрещено помещать в организм женщин. Яйцеклетки и сперматозоиды для опытов будут браться у пары после прохождения процедуры ЭКО. Модифицируя эмбрионы человека, исследователи намерены выявить гены, которые наиболее активно действуют в первые дни жизни плода, когда эмбрион формирует клетки – основу будущей плаценты. Эти гены будут включать и отключать при использовании CRISPR-Cas9, что поможет решить проблему выкидышей. В Китае генетикам впервые в истории удалось видоизменить геном эмбриона человека. Для работы была задействована CRISPR-Cas9, с помощью которой из ДНК был удален мутантный ген HBB, являющийся причиной бета-талассемии, тяжелого генетического заболевания крови, вызывающего массу крайне неприятных последствий: деформацию черепа и костей, умственную отсталость.ПлюсыНа наших глазах создается медицина будущего – биомедицина. Генная терапия может привести к решительному перелому в истории медицины: не исключено, что в скором времени человечество будет выбирать лечение из набора вполне доступных генетических операций. Наступит день, когда с помощью технологий генного редактирования можно будет сделать свою ДНК полностью здоровой.Редактирование генома на сегодня одно из самых перспективных направлений в науке, ориентированной на благо человечества (см. схему 2), вот почему предполагается, что технология CRISPR будет использована для того, чтобы бороться с вирусом иммунодефицита человека, онкозаболеваниями или исправлять генетические нарушения, например, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, наследственную гемофилию. Кроме того, появится возможность исправления генетических дефектов у эмбрионов, созданных путем ЭКО.В сельском хозяйстве эта технология может использоваться для редактирования геномов важных для человечества культур сои, риса, пшеницы, сорго, кукурузы, томатов и апельсинов, удешевляя и ускоряя их производство. Считается, что концепция ГМО более неприемлема, поскольку в геном сельскохозяйственных культур в обязательном порядке включается чужеродная ДНК, тогда как CRISPR-технология может использоваться лишь для модификации существующего генома – например, для удаления аллергенов из арахиса. Исследуются возможности внедрения систем CRISPR-Cas в культурные растения для создания противовирусного иммунитета.Ведутся работы по редактированию геномов с помощью CRISPR-Cas у крупного рогатого скота, свиней и других животных сельскохозяйственного назначения. Их цель – ускоренный рост и наращивание мышечной массы. В ноябре 2015 года были опубликованы результаты эксперимента, в ходе которого при помощи технологии CRISPR-Cas в геноме свиньи были одновременно инактивированы 62 эндогенных ретровируса, а это открывает возможность ксенотрансплантации органов от свиньи к человеку. Еще мутагенез с использованием CRISPR-Cas может использоваться в борьбе с инвазивными видами (например, для создания комаров, неспособных переносить малярию, лихорадку Денге или вирус Зика).Наконец, меняя метаболические ферменты бактерий, можно заняться более продуктивной биотехнологической очисткой воды, спасением лесов на планете (увеличив рост и скорость роста деревьев), улучшить технологию переработки биотоплива…МинусыОднако мировое сообщество считает, что редактировать гены эмбрионов опасно, так как они передают измененную ДНК следующим поколениям, и незаметные на первый взгляд последствия, накапливаясь, в будущем могут нанести непоправимый вред эволюции человечества – генетической и культурной. Помимо этого эффективная система модификации генов может оказаться в руках тех, кто намерен использовать ее в военных целях либо для создания человеческой «элиты» (возврат к евгенике).Факты2005 год – государствами – членами ЮНЕСКО принята Всеобщая декларация о биоэтике и правах человека (геном человека является частью наследия человечества).Декабрь 2015 года, Вашингтон – состоялся первый Международный саммит по редактированию генов человека (участники – Китай, США, Великобритания).Февраль 2016 года, Лондон – группа британских ученых (Институт Фрэнсиса Крика) получила разрешение на генетическую модификацию человеческих эмбрионов с помощью CRISPR-Cas и родственных методов.Февраль 2016 года – методика редактирования ДНК системой CRISPR-Cas успешно применена для редактирования РНК (для этого создана короткая нуклеиновая кислота PAMmer, которая вместе с направляющими РНК направляет Cas9 к молекуле РНК). Литература и источникиhttp://unesdoc.unesco.org/images/0023/002332/233258E.pdf – доклад ЮНЕСКО «Переосмысление человеческого генома и прав человека» (на английском языке).Pennisi E. The CRISPR Craze. (2013) Science 341, 833 – популярная статья в Science (на английском языке) об истории открытия CRISPR.Schumann K. et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. (2015) PNAS 112, 10437 – оригинальная статья о Cas9-редактировании первичных Т-лимфоцитов человека. Руководитель исследования считает, что Т-клетки создаются заново в каждом человеке, поэтому их модификации не будут переданы следующим поколениям, что в будущем может использоваться в клинической практике для коррекции иммунодефицитных, инфекционных и онкологических заболеваний.Liang P. et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. (2015) Protein & Cell 6, 363 – оригинальная статья об использовании CRISPR-Cas9 для редактирования человеческого генома в предимплантационных эмбрионах. Помимо низкой точности редактирования и ряда нежелательных мутаций эксперименты были негласно признаны научным сообществом неэтичными.Немудрый А.А. и др. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas – инструменты открытий (2014) Acta Naturae, т. 6, № 3 (22), с. 20-42 – детальная обзорная статья о механизмах действия систем TALEN и CRISPR/Cas.Светлана ХОРОНЕНКОВА, кандидат химических наук
Выбор читателей
Комментарии